常用的實(shí)驗(yàn)動物一般都有對應(yīng)的白變種品系，如BALB/c小鼠、SD大鼠、白化豚鼠、新西蘭大白兔等，能滿足特定實(shí)驗(yàn)需求。為了更好地使西藏小型豬滿足科研實(shí)驗(yàn)需求，本單位通利用CRISPR/Cas9受精卵注射法獲得了TYR基因敲除白化西藏小型豬。該方法可有效避免了體細(xì)胞核移植法所引起的胚胎發(fā)育延遲、出生后存活率低、同一細(xì)胞克隆株所獲得的性別單一等問題。此外，受精卵由胞質(zhì)內(nèi)注射法所獲得的F0代并不攜帶外源豬種的線粒體DNA，很好地保留了西藏小型豬的其他特性。外觀上看，白化西藏小型豬和普通西藏小型豬，除了眼睛和皮毛發(fā)顏色不一樣外，其他無太大差別。TYR基因敲除西藏小型豬，因黑色素合成障礙，導(dǎo)致全身皮膚和毛發(fā)呈白色，眼睛呈紅色，呈典型的白化癥狀。與野生型西藏小型豬相比，白化西藏小型豬的耳緣靜脈更加清晰，利于實(shí)驗(yàn)時(shí)靜脈注射給藥。白化西藏小型豬的皮膚在進(jìn)行炎癥和損傷觀察時(shí)更加清晰，且還可很方便地在其皮膚或毛發(fā)上做標(biāo)記。

由于白化病為隱性遺傳病，白化個(gè)體并不攜帶野生型TYR等位基因，白化個(gè)體間交配繁殖只能生出白化個(gè)體，育種相對方便。白化突變動物通常在野生自然環(huán)境下會因長期受到太陽紫外線照射引起損傷或癌變，而容易被自然選擇淘汰。為了驗(yàn)證TYR基因敲除白化西藏小型豬是否適合培育成實(shí)驗(yàn)用小型豬新品系，我們對其一些常用指標(biāo)進(jìn)行了檢測。目前已通過TYR敲除的F0代間交配繁殖目前已獲得了F1代、F2代、F3代TYR基因敲除白化西藏小型豬。

白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的各體尺指標(biāo)之間無明顯差異，表明了白化西藏小型豬與同齡的普通西藏小型豬的體型相近，二者的生長發(fā)育速度保持一致。同時(shí)也表明了白化西藏小型豬在普通飼養(yǎng)環(huán)境能正常生長發(fā)育。通過分析和比較白化西藏小型豬與普通西藏小型豬的繁殖性能指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)它們的繁殖性能相似，說明白化小型豬在普通飼養(yǎng)環(huán)境下能正常繁殖，不受TYR基因失活的影響。

初步統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)白化西藏小型豬的血液生理指標(biāo)與普通西藏小型豬的血液生理指標(biāo)絕大部分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不過白化西藏小型豬的MCHC略高于普通西藏小型豬的MCHC。但由于動物的血液生理學(xué)指標(biāo)也會因年齡、性別、營養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)等而有所差異的。總體來說，白化西藏小型豬的血液生理指標(biāo)與普通西藏小型豬的血液生理指標(biāo)基本一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TYR基因功能失活的白化西藏小型豬，除了皮毛和眼睛顏色與普通正常西藏小型豬不一樣外，各項(xiàng)體尺指標(biāo)、繁殖性能指標(biāo)、血液生理和生化指標(biāo)等與普通西藏小型豬的對應(yīng)指標(biāo)基本保持一致。TYR基因敲除白化西藏小型豬能在普通級動物飼養(yǎng)環(huán)境下很好地存活和繁殖。白化西藏小型豬由于皮膚和毛發(fā)白色，更利于耳緣靜脈給藥和皮膚實(shí)驗(yàn)的觀察。此外也可作為白化病大動物模型進(jìn)一步研究。我們認(rèn)為TYR基因敲除白化西藏小型豬適合用作實(shí)驗(yàn)小型豬新品系，滿足科研實(shí)驗(yàn)需求。

酪氨酸酶基因敲除白化西藏小型豬是通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除TYR基因而獲得的，沒有插入任何外源基因，為非轉(zhuǎn)基因動物。獲得的白化西藏小型豬由于是通過受精卵胞質(zhì)注射法而制備的，不攜帶異種品系豬的線粒體DNA——母系遺傳物質(zhì)，能保持品系的純正。所用的受精卵均通過手術(shù)體內(nèi)沖卵獲得，沒有到屠宰場采集卵巢和卵母細(xì)胞，生物安全可控。TYR突變引起的白化為隱性性狀，可通過白化藏豬之間交配繁殖保種，得到的后代均為白化，能穩(wěn)定遺傳。白化藏豬在普通實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)環(huán)境能正常繁殖存活，但在野外環(huán)境會受到長時(shí)間太陽紫外線照射而引起皮膚損傷，且沒有原有保護(hù)色容易被天敵發(fā)現(xiàn)和捕殺，野生條件下不易存活，生物安全性高。

Hprt基因編碼的蛋白是一種轉(zhuǎn)移酶，在嘌呤核苷酸的生成過程中起著中心作用。該基因的突變會導(dǎo)致Lesch-Nyhan綜合征或痛風(fēng)，Lesh-Nyhan綜合征是一種罕見的由HPRT基因突變引起的x連鎖隱性遺傳疾病。突變通過從頭合成和積累尿酸導(dǎo)致嘌呤核苷酸的過量生產(chǎn)，并導(dǎo)致神經(jīng)和行為表型的可變頻譜。患者表現(xiàn)出與全身肌張力障礙相關(guān)的嚴(yán)重運(yùn)動障礙，有時(shí)伴有舞蹈手足口病或痙攣；許多患者也有認(rèn)知障礙，并表現(xiàn)出不尋常的危險(xiǎn)行為傾向。Hprt缺乏也會對體細(xì)胞生長、骨髓干細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞以及胃腸道功能產(chǎn)生不良影響。常見癥狀包括吞咽困難、不明原因的嘔吐、便秘和腹脹。

F0 代構(gòu)建

Hprt基因編碼的蛋白是一種轉(zhuǎn)移酶，通過5-磷酸核糖基1焦磷酸轉(zhuǎn)移，催化次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為肌苷單磷酸，鳥嘌呤轉(zhuǎn)化為鳥苷單磷酸。這種酶在嘌呤核苷酸的生成過程中起著中心作用。該基因的突變會導(dǎo)致Lesch-Nyhan綜合征或痛風(fēng)，Lesh-Nyhan綜合征是一種罕見的由HPRT基因突變引起的x連鎖隱性遺傳疾病。突變通過從頭合成和積累尿酸導(dǎo)致嘌呤核苷酸的過量生產(chǎn)，并導(dǎo)致神經(jīng)和行為表型的可變頻譜。患者表現(xiàn)出與全身肌張力障礙相關(guān)的嚴(yán)重運(yùn)動障礙，有時(shí)伴有舞蹈手足口病或痙攣；許多患者也有認(rèn)知障礙，并表現(xiàn)出不尋常的危險(xiǎn)行為傾向。神經(jīng)行為表型與基底神經(jīng)節(jié)功能障礙有關(guān)，特別是多巴胺能通路。Hprt缺乏也會對體細(xì)胞生長、骨髓干細(xì)胞成熟為紅細(xì)胞以及胃腸道功能產(chǎn)生不良影響。常見癥狀包括吞咽困難、不明原因的嘔吐、便秘和腹脹。