小鼠顱窗的制作和雙光子顯微鏡活體成像為本模型構建的難點，對個人技術要求較高，需要長期練習并且具有麻醉、解剖、生理等跨學科知識儲備。

本模型為同源小鼠膠質瘤模型，較異源模型更能模擬臨床上腫瘤病人血管增生，腫瘤彌散性侵襲生長，尤其是探究膠質瘤細胞在惡性增殖過程中與免疫細胞的相互作用關系。如結合免疫細胞表達特異熒光的轉基因小鼠即可探究特定免疫細胞對膠質瘤惡性增殖的影響。同時其它基質細胞，如周細胞等亦可借助此模型進行研究。

C57BL/6購自北京唯尚立德生物科技有限公司小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，機體內無特定的病原微生物和寄生蟲存在。腫瘤細胞體外培養(yǎng)和凍存都嚴格按照實驗流程操作。細胞和小鼠均沒有向自然環(huán)境外溢，無環(huán)境和生態(tài)威脅。

圖2.小鼠膠質瘤活體成像。紅色：GL261-Tdtomato，綠色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 μm。

如上圖2所示，接種腫瘤后第七天，實體膠質瘤已經在顱內形成，且呈彌散性生長。白色箭頭顯示的是單個腫瘤細胞，綠色箭頭指FITC-Dextran透過血腦屏障外滲。這說明隨著腫瘤生長，血腦屏障收到破壞。接下來，第10天、第13天，膠質瘤細胞增長迅速，直徑已經超過1 mm。并且血管成像顯著的病理性改變。

圖3.小鼠膠質瘤惡性增殖并伴隨血管增生。紅色：GL261-Tdtomato，綠色：血管，i.v. FITC-Dextran。深度：0-300 μm。

如上圖3所示，紅色為惡性增殖的膠質瘤細胞，綠色為不同時間節(jié)點血管成像情況。在第10天、13天部分腫瘤區(qū)域未檢測到紅色熒光信號，我們推測可能是腫瘤增長過快，導致部分區(qū)域缺血、缺氧出現壞死所致。而從第7天到第13天能明顯看到血管的增生及病理性改變，這與臨床膠質瘤患者是一致的。

為了進一步量化腫瘤生長及血管的增生情況，我們將獲取的三位立體圖像通過Imaris軟件進行了重構和計算。結果如圖4所示，膠質瘤和血管的體積和表面積隨著時間變化有著顯著的增長過程。

圖4.小鼠膠質瘤及血管的體積和表面積統計圖。

雖然雙光子活體成像可以動態(tài)跟蹤觀察單細胞水平腫瘤在顱內的生長情況，但是其觀測深度只能到達皮層下500-700 μm。為了更全面的展現膠質瘤在顱內的生長情況，我們在后期也通過核磁（Magnetic Resonance Imaging， MRI）對小鼠的膠質瘤生長情況進行了跟蹤觀察。如下圖5所示，膠質瘤在顱窗下生長迅速。第二十天已經跨兩側腦半球進行生長。在第20天和26天膠質瘤分為幾部分生長，而到了第32天這幾部分已經張到一起。直徑也達到5 mm左右。在獲取了MRI影像學數據后我們也同樣通過Imaris對其進行了三位立體構建，并計算了其變化情況。結果顯示其增長迅速。

圖5.小鼠膠質瘤MRI成像及分析。

圖1.小鼠膠質瘤活體成像模型構建。A. GL261-Tdtomato細胞系。B. 小鼠顱窗的制作。C. 腫瘤細胞腦原位接種。D.小鼠腦雙光子活體成像。

模型制作方法如上圖1所示：

首先，將Ubi-MCS-SV40-Neomycin (Genechem Co.,Ltd, Catalog No. CV084)慢病毒載體轉染到GL261-WT腫瘤細胞系內，以構建可以表達紅色熒光的GL261-Tdtomato細胞系。

其次，將小鼠腦部毛發(fā)去除，剪掉皮膚，暴露顱骨后通過牙科鉆頭鉆一個直徑約5.0-5.5 mm的孔洞，并將其移除。暴露腦后需要移除硬腦膜，并粘上直徑為6.0 mm的透明玻璃片。

第三，上述手術三到四周后將顱窗移除，將1 μl包含5×104個GL261-Tdtomato細胞的腫瘤細胞懸液原位注射到一側大腦半球，并重新粘上玻璃片，做好顱窗。

第四，約一周后通過雙光子顯微鏡成像技術動態(tài)跟蹤觀察。

一、疾病概述

膠質瘤是指由膠質細胞發(fā)生癌變，惡性增殖而形成的腫瘤，是最為常見的原發(fā)性顱內腫瘤。包括多形性膠質母細胞瘤（GBM, Glioblastomas multiforme）、間變性星形細胞瘤（AA, Anaplastic astrocytomas）、間變性少支星形細胞瘤（AOA, Anaplastic oligoastrocytomas）間變性少支膠質細胞瘤（AO, Ananplastic oligodendrogliomas）等1。其中多形性膠質母細胞瘤（GBM）發(fā)病率最高，占所有膠質瘤的一半以上，年發(fā)病率約為3.19/10萬2。雖然有很多治療手段，如常用的治療方案為手術，加術后放療及替莫唑胺（TMZ）同步化療，然后為6個療程的TMZ單獨輔助化療。但療效并不盡如人意，總的生存期（OS）僅為12-18個月3。嚴峻的現實急需對其病理病程進行深入研究，探尋新的潛在治療靶位點，以優(yōu)化治療方案，提高患者生活質量及生存時間。

二、研究背景

1、 GL-261膠質細胞瘤信息

GL-261為鼠源膠質瘤細胞系。是常用的用于膠質瘤研究的腫瘤細胞系，體外培養(yǎng)方便，增值快。體內原位注射到小鼠腦后生長迅速，能很好再現臨床膠質瘤血管增生等特征。

2、實驗動物背景信息

C57BL/6是常用近交系小鼠品系，因其群體基因高度純合和穩(wěn)定，繁殖能力強，壽命長等因素廣泛應用于腫瘤學和其它多項研究領域。

3、研究背景

雖然科學家建立了很多膠質瘤動物模型，如GL-261小鼠皮下腫瘤模型4，GL-261腦原位小鼠模型等5。但這些模型不能在單細胞水平動態(tài)跟蹤觀察膠質瘤細胞在顱內的生長狀況，及與基質細胞和血管的相互作用關系。雖然，也有科學家借助雙光子顯微鏡構建了小鼠活體成像模型，但其實驗中用到的為免疫缺陷小鼠6，不能很好再現臨床上免疫功能健全的患者膠質瘤生長與免疫細胞的相互作用關系。而應用鼠源的GL-261細胞系及免疫功能健全的C57BL/6小鼠恰能解決這個問題。